Laboratoriji za biohemiju lipida

U laboratoriji za biohemiju lipida određuju se profili masnih kiselina u biološkim uzorcima i sadržaj masnih kiselina u namirnicama tehnikom gasno-tečne hromatografije. Profili masnih kiselina predstavljaju biomarker dijetarnog unosa masnih kiselina, tako da se dobijeni rezultati mogu koristiti u kako u istraživanjima, tako i u cilju davanja saveta za ishranu u skladu sa profilima masnih kiselina seruma i eritrocita.

U daljem tekstu možete pročitati više o:

  • Analizi masnokiselinskog sastava biološkog materijala i životnih namirnica
  • Proučavanju uticaja prirodnih sokova na profil masnih kiselina fosfolipida seruma i oksidativnog statusa kod profesionalnih sportista i osoba sa metaboličkim sindromom    
  • Masnim kiselinama kao biomarkerima dijetnog unosa
  • Trans masnim kiselinama        

                                            ***************************************

Analiza masnokiselinskog sastava biološkog materijala i životnih namirnica

Laboratorija za istraživanje lipida u biološkim uzorcima i nekim životnim namirnicama, predstavlja važno mesto istraživanja u CENM. U njoj se svakodnevno izoluju lipidi iz humanih i animalnih uzoraka seruma, plazme, eritrocita i animalnih tkiva, a u novije vreme i iz humanih tkiva različitih patologija, među kojima su najčešće kancerogena. Osim izolovanja ukupnih lipida, izoluju se i različite lipidne klase i određuju profili masnih kiselina u ukupnim lipidima i fosfolipidima. Masnokiselinski profili predstavljaju biomarkere dijetarnog unosa masnih kiselina ali i njihove endogene sinteze. Dobijeni rezultati koristite se kao polazne osnove za nutitivnu intervenciju kod svakog ispitanika, ali i u daljim istraživanjima u cilju prevencije eventulanih kardiovaskularnih događaja kod ispitanika.
Analiza masnokiselinskog sastava biološkog materijala i životnih namirnica podrazumeva sledeće korake:1.

  1. Ekstrakciju ukupnih lipida
  2. Izolovanje lipidnih klasa
  3. Transesterifikaciju masnih kiselina u metil-estre
  4. Analizu masnih kiselina gasno-tečnom hromatografijom.

Ekstracija ukupnih lipida u našoj laboratoriji vrši se smešom organskih rastvarača hloroform:metanol 2:1 (v/v). Modifikacijom metode po Folč-u efikasno se estrahuju lipidi seruma i plazme, dok se za estrakciju lipida eritrocita, sa visokim sadržajem fosfolipida, koriste metode po Harth-u, smešom rastvarača hloroform:methanol 1:1 (v/v), ili po Rosu, smešom izopropanol:hloroform 11:7 (v/v). Među analiziranim animalnim tkivima najčešći su jetra, srce i mozak, a među prehrambenim namirnicama različita ulja, mleko i mlečni proizvodi, tradicionalna jela, kafa i semenke bogate uljima. U novije vreme razvili smo metodu za analizu masnih kiselina u ukupnim lipidima, koja podrazumeva direktan proces transesterifikacije bez predhodnog izolovanja lipida, sa istim prinosom i tačnošću. Osim toga uveli smo metodu za određivanje profila masnih kiselina u trombocitima.
Za razdvajanje lipidnih klasa koristi se tankoslojna hromatografija (eng: Thin Layer Chromatography – TLC) na slika gelu. Кao sistem razvijača koristi se: petroletar (40-65°S):dietiletar:sirćetna kiselina (87:12:1). Identifikacija lipidnih klasa: fosfolipida, holesterola, diglicerida, monogliceridia, ne-esterifikovanih masnih kiselina, triglicerida i holesterol-estara, postiže se UV-lampom. Budući da razdvajanje lipidnih klasa na TLC pločama može dovesti do oksidacije masnih kiselina, razvili smo metodu razdvajanje klasa lipida na aminopropilenskim-silika kolonama, gde neutralne lipide razdvajamo od ne-esterifikovanih masnih kiselina i fosfolipida smešom rastvarača izopropanol-hloroform 1:2 (v/v), metanol sa 2% sirćetnom kiselinom, i ponovo metanolom.
Fosfolipidne frakcije razdvajaju se u našoj laboratoriji na silika gelu H uz dodatak florisila, na nekoliko načina:
a) razdvajanjem u jednoj dimenziji korišćenjem alkalnog razvijača hloroform: methanol: 20% amonijum-hidroksid (65:30:5, v / v / v), gde se postiže razdvajanje serumskih fosfolipida na frakcije: lizofosfatidilholin, sfingolipidi, fosfatidilholin, fosfatidietanolamin.
b) razdvajanjem u jednoj dimenziji na HP-TLC pločama koristeći razvijač hloroform-n-propanol-etil-čacetat-metanol-0.15% kalijum-hlorid (12.5:12.5:12.5:7.5:4.5 v /v /v /v /v), gde se fosfolipidi eritrocita i jetre razdvajaju na sfingolipide, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol i fosfatidiletanolamin
c) dvodimenzionalnom hromatografijom pri čemu se za prvu dimenziju koristi alkalni razvijač kao u jednodimenzionalnoj hromatografiji, a za drugu dimenziju system razvijača hloroform-aceton-metanol-sirćetna kiselina-voda (70:17,5:12,5:10:4,4 v / v / v / v / v). Na ovaj način fosfolipidi se razdvajaju na lizolecitin, fosfatidilholin, sfingolipidi, fosfatidiletanolamin, difosfatidilglicerol, fosfatidilinozitol, fosfatidilserin i fosfatidnu kiselinu.
Sadržaj fosfolipida određuje se određivanjem koncentracije fosfora posle mineralizacije uzoraka. U narednom periodu planiraju se analize masnokiselinskog sastava pojedinačnih frakcija fosfolipida, i uvođenje metode kojom je moguće postignuti zadovoljavajuće razdvajanje fosfolida na frakcije u jednoj dimenziji na nemodifikovanim HP-TLC pločama. To će omogućiti jednostavno i brzo densitometrijsko određivanje nivoa fosfolipida.
Nedavno je uvedena je metoda kojom se smešom aceton:n-heksan postiže selektivno taloženje sfingomijelina iz eritrocita i seruma. Time je sa jedne strane omogućeno ispitivanje uticaja sfingolipida na različite patološka stanja, a sa druge ova metoda predstavlja efikasan tehnološki postupak za izolovanje sfingolipida.
Proces transesterifikacije masnih kiselina unapređen je u odnosu na ranije korišćenu bazno-kiselu esterifikaciju u trajanju od 3 sata, transmetilacijom 3N HCl-om u metanolu na 85°S u trajanju od 60 minuta, sa istim prinosom i tačnošću rezultata.
Metil-estari masnih kiselina analiziraju se na gasnom hromatografu Shimadzu 2014 (Кyoto, Japan) koji je opremljen kolonom RESTEК Rtx 2330 (RESTEК, Bellafonte, Pa., USA). Od nedavno gasni hromatograf opremljen je autoinjektorom AOS-20i, čime je ručno injektovanje zamenjeno automatskim i tako omogućeno analizirati veći broj uzoraka u toku dana. Metil estri masnih kiselina identifikuju se poređenjem retencionih vremena sa retencionim vremenima standarda (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) i/ili PUFA-2 standardne smeše (Supelco, Inc., Belleforte, Pa., USA). Rezultati se izražavaju kao procenti od ukupnih identifikovanih masnih kiselina ili u apsolutnim količinama, kada se u toku pripreme uzoraka doda interni standard. Moguće je analizirati nmol količine uzoraka.

Proučavanje uticaja prirodnih sokova na profil masnih kiselina fosfolipida seruma i oksidativnog statusa kod profesionalnih sportista i osoba sa metaboličkim sindromom

Naša dosadašnja istraživanja pokazala su da dugotrajno profesionalno bavljenje sportom ima uticaja na metabolizam lipida i masnih kilelina, kao i da sportisti oba pola imaju promenjen masnokiselinski profil u odnosu na ispitanike koji nisu fizički aktivni. Nekada te promene mogu biti nepovoljne, i u takvim situacijama neophodno je nutritivno intervenisati. Osim promena u metabolizmu lipida, naša ispitivanja su pokazala da redovna, intenzivna fizička aktivnost menja redoks ravnotežu u organizmu jer povećava nivo slobodnih radikala u plazmi i aktivnosti enzima antioksidativne zaštite u eritrocitima. Iz tih razloga, a u saradnji sa klubskim lekarima, organizovane su dve studije sa kadetima oba pola koji treniraju rukomet, koji su u toku 28 dana konzumirali 100ml soka od aronije. Aronija u svojim plodovima sadrži veliku koncentraciju antioksidanasa, vitamina i minerala. Rezultati naših studija su pokazali da se masnokiselinski profil fosfolipida seruma nije menjao, dok je sok od aronije pozitivno delovao na ukupni antioksidativni status i lipidnu peroksidaciju kod svih ispitanika. Imajući u vidu rezultate ovih studija, možemo da zaključimo da aktivne komponente soka aronije mogu da smanje oksidativni stres u organizmu, koji je izazvan dugogodišnjom, svakodnevnom fizičkom aktivnošću.
Nakon studije koju smo organizovali kod aktivnih sportista, naša dalja istraživanje išla su u smeru ispitivanja efekata drugih prirodnih sokova bogatih antioksidansima na masnokiselinski profil i aktivnost enzima antioksidativne zaštite, u različitim patološkim stanjima. Studije koje su do sada organizovane podrazumevale su konzumiranje 300ml soka od nara, u trajanju od 2 i 6 nedelja, kod osoba kod kojih je potvrđeno prisustvo metaboličkog sindroma. Кonzumiranje soka od nara uticalo je na masnokiselinski profil fosfolipda plazme i eritrocita u obe studije. Pozitivni efekat konzumiranja soka od nara, u studiji koja je trajala dve nedelje, ogledao se u zaštiti dugolančanih masnih kiselina u fosfolipidima plazme i eritrocita od oksidacije, dok je u studiji koja je trajala šest nedelja, primećen evetualni uticaj soka od nara na aktivnost nekih enzima koji su uključeni u proces biosinteze masnih kiselina. Važno je istaći, da je konzumiranje soka od nara u obe studije dovelo do smanjenja aktivnosti enzima glutation peroksidaze, koja je generalno povećana kod osoba sa metaboličkim sindromom. Predloženi mehanizam oslanja se na sposobnost aktivnih komponenata nara da heliraju vodonik-peroksid i tako smanjuju njegovu koncentraciju u plazmi, a time doprinose smanjenju aktivnosti enzima čija je uloga da prevodi vodonik-peroksid do vode. Ispitivanje preciznog mehanizma kojim polifenoli iz nara, ali i drugog voća, deluju na metabolizam masnih kiselina i aktivnost enzima antioksidativne zaštite, predstavlja izazov kojim ćemo se baviti u narednom periodu.

Masne kiseline kao biomarkeri dijetnog unosa

Masne kiseline fosfolipida seruma ili plazme dokazani su biomarker unosa, te se koriste kao objektivni biohemijski indikator tokom dijetnih interventnih studija. Poslednjih godina akcenat je više na kvalitetu nego kvantitetu unosa masti, jer se i pored smanjenog unosa masti, kalorijski unos nije smanjio kao ni broj gojaznih osoba i broj obolelih od dijabetesa tipa 2. Velik broj istraživanja bavi se pitanjem optimalni količinski /kvantitativni/ unos masti i kog sastava /kvalitativno/ vrste masnih kiselina koji dovodi do pozitivnih efekata na zdravlje. Masti iz hrane su povezane sa velikim brojem hroničnih nezaraznih bolesti, smatraju se nezavisnim faktorom rizika za nastanak kardiovaskularnih oboljenja, utiču na pojavu ateroskleroze i oboljenja srca najviše porastom nivoa holesterola. Sama redukcija učešća masti u ishrani na 30 % dnevnog energetskog unosa dovodi do snižavanja nivoa holesterola za 0.50mmol/L.
Fosfolipidi seruma reflektuju dijetarni unos, metabolizam masti ali i sastav fosfolipida membrana tkiva. Profil masnih kiselina fosfolipida seruma pokazatelj je unosa esencijalnih masnih kiselina i pokazuje količine i vrste masti koje se putem hrane unose u organizam. Budući da masne kiseline zastupljene u ishrani utiču na sastav i funkciju membranskih fosfolipida, dužina i stepen nezasićenosti masnih kiselina fosfolipida značajni su faktori u održavanju optimalne membranske fluidnosti i transporta kroz ćelijsku membranu što je značajno u patogenezi nastanka hiperlipidemija, ateroskleroze, hipertenzije i gojaznosti u osnovi-tretiranih kao nutritivno-bazirane bolesti. Masne kiseline se tokom eritropoeze ugradjuju u membrane eritrocita ili formirani eritrociti podležu interakciji sa masnim kiselinama seruma. Eritrociti reflektuju profil masnih kiselina serumskih lipida i smatraju se prihvatljivim modelom za ispitivanje opšteg metabolizma masnih kiselina. Iz tog razloga se u našoj laboratoriji određuju masne kiseline fosfolipida seruma/plazme i erotrocita.
Promene u masnim kiselinama fosfolipida tokom dijetnog tretmana nastaju posle šest nedelja do tri meseca i ove promene se održavaju do šest meseci. Polinezasićene masne kiseline imaju različito učešće u lipidnim pulovima, deluju na ranu stepenicu ćelijske aktivacije, i na stvaranje pro- i antiinflamatornih lipidnih medijatora – eikosanoida pre svega utiču dijetne masne kiseline. Ovo indikuje da masne kiseline moduliraju ključnu stepenicu u regulaciji ćelijske funkcije jer su eikosanoidi snažni regulatori ćelijskih funkcija i kao takvi vrlo značajni u fiziologiji i patofiziologiji kardiovaskularnog sistema a samim tim i u patogenezi ateroskleroze. Važno je istaći da se poslednjih godina definisao omega-3 indeks (%EPA+DHA u eritrocitima) koji se smatra potencijalnim faktorom rizika za kardiovaskularni mortalitet pre svega za iznenadnu srčanu smrt.
Rezultati našeg istraživačkog rada pokazuju promene u masnokiselinskom sastavu fosfolipida plazme i eritrocita u različitim patološkim stanjima. Dijetoterapija je dovela doznačajnih promena u sastavu masnih kiselina, što je za rezultat imalo smanjenje faktora rizika posebno kod osoba sa metaboličkim sindromom. Napred navedeno ukazuje da je važno pratiti i promene sastava masnih kiselina tokom medikamentozne terapije što vodi ka adekvatnoj ciljanoj nutritivnoj terapiji.
Promene u masnokiselinskim sastavima krvi i tkiva uočene su u brojnim studijama sprovedenim u našoj laboratoriji: pacijenta sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom na programu hemodijalize, pacijenata sa cirozom jetre, dijabetičara, gojaznih osoba sa različitim stepenom osetljivosti na insulin, pacijenata sa kancerom, sportista. Nekoliko suplementacionih studija pokazalo je povoljne efekte suplementacije ribljim uljem, uljem žutog noćurka, ali takođe i suplementacija sokovima bogatim polifenolima – sok od nara ili aronije, doveli su do značajnih poboljšanja zdravlja, smanjenja faktora rizika kod bolesnika sa reumatoidnim oboljenjima, metaboličkim bolestima, ali i smanjenja oksidativnog stresa kod vrhunskih sportista.
Analiza dijetarnog unosa u našoj populaciji pokazuje neadekvatan unos pre svega omega-3 masnih kiselina, ali generalno se može zaključiti da se većina populacije nepravilno hrani. Unos trans masti je neprihvatljivo visok. Ipak, uočene su značajne razlike u unosu kod pacijenata sa kancerom pluća u odnosu na zdravu kontrolnu grupu. Razlike u fosfolipidima plazme i tkiva bolesnika sa kancerom pluća u odnosu na zdravu populaciju ukazuju na potrebu za promenom režima ishrane i suplementacijom bolesnika i u smislu prevencije, i u toku terapije, što je rezultovalo u doktorskoj disertaciji.
Trans masne kiseline nisu prisutne u prirodi, ali nastaju u procesu proizvodnje i obrade namirnica. Zbog njihovog negativnog efekta, pre svega na rizik za nastanak kardiovaskularnih oboljenja i maligniteta, preporučeni unos ishranom je manji od 1g/dnevno. Analizom sadržaja trans masnih kiselina u serumu i tkivima možemo pratiti uticaj unosa trans masnih kislina na razvoj nekih patologija (kardiovaskularna oboljenja, insulinska rezistencija, bolesti jetre, kanceri… ). Analiza margarina na našem tržištu pokazala je veoma visok sadržaj trans masti,posebno u stonim, čvrstim margarinima i ukazala na potrebu da Srbija sledi primer mnogih Evropskih (i drugih) zemalja i zakonskom regulativom ograniči sadržaj trans masti u namirnicama. Ovi rezultati publikovani su u vrhunskom međunarodnom časopisu.
Identifikacija i kvantifikacija zasićenih i polinezasićenih masnih kiselina u proizvodima na tržištu, kao i priprema novih proizvoda recimo obogaćenih n-3 masnim kiselinama, omogućava nam saradnju sa privredom. Proizvodi prehrambene industrije trebaju da imaju kompletan sastav količine, ali i vrste masti na svojim pakovanjima u smislu «nutrition labeling» što je u svetu dugogodišnja praksa jer omogućava adekvatan odabir namirnica u pravilnoj ishrani.

Trans masne kiseline

Trans masne kiseline (TMК) su nezasićene masne kiseline koje imaju najmanje jednu dvogubu vezu u trans konfiguraciji. Najčešće se dobijaju industrijskim putem, delimičnom hidrogenizacijom biljnih ili ribljih ulja. Na taj način ulja dobijaju čvrstu strukturu i postaju pogodna za upotrebu u pekarskoj i konditorskoj industriji. Prirodne TMК postoje samo u mesu, mleku i mlečnim proizvodima preživara, pre svega krava i ovaca, ali procenat trans masti u ovim proizvodima iznosi 3-6% od ukupnih masti. Za razliku od industrijskih TMК, za koje je nedvosmisleno pokazano da su veoma štetne po zdravlje, podaci o štetnosti ili eventualno blagotvornom efektu prirodnih trans masti na organizam čoveka su oprečni.
Dijetarni unos TMК vodi povećanju koncentracije štetnog LDL holesterola u krvi, smanjenju nivoa korisnog HDL – holesterola i povećanom riziku od oboljenja kardiovaskularnog sistema i infarkta miokarda. Naučne studije su pokazale da ako se samo 2% kalorija koje dnevno unesemo putem šećera zamene trans mastima, rizik od infarkta se povećava za 24%. Ukoliko 2% dnevnog unosa kalorija poreklom iz polinezasićenih masnih kiselina (npr. iz suncokretovog ulja ili masne morske ribe) zamenimo TMК, rizik od srčane smrti se povećava za čak 32%. Zbog toga je Svetska Zdravstvena Organizacija 2004. godine donela preporuku da se dnevni unos trans masti ograniči na 1% unosa energije dnevno. TMК se pre svega nalaze u industrijski prerađenoj hrani. Ima ih u margarinima, posebno u stonim margarinima koji se koriste za pripremu kolača. S obzirom da Srbija nema zakonsku regulativu kojom se limitira sadržaj trans masti u namirnicama, sproveli smo studiju u kojoj smo odredili sadržaj TMК u svim margarinima koje smo našli na našem tržištu. Zaključili smo da je sadržaj TMК u margarinima za mazanje relativno nizak, sa izuzetkom jednog margarina, ali da je u čvrstim margarinima taj udeo i do 28% od ukupnih masti. U Evropskim zemljama koje imaju legislativu o TMК, sadržaj je ograničen na 2% ukupnih masti, što pokazuje koliko je nama takva legislativa neophodna. Iz tog razloga naš Centar je održao nekoliko predavanja i tribina, saradnici Centra su pokrenuli inicijativu da se uvede zakonska regulativa o sadržaju TMК u hrani i gostovali na Okruglom stolu u Skupštini Republike Srbije, kako bi se poslanici upoznali sa ovim problemom. Znajući sastav margarina na tržištu, moglo se očekivati da su i industrijske namirnice bogate TMК. Hrana koja sadrži industrijske margarine, lisnata testa, napolitanke, razne vrste keksa, eurokrema i ostalih slatkiša je takođe potencijalni izvor TMК. Iz tog razloga naš Centar je u okviru bilateralnog projekta sa Slovenijom analizirao namirnice iz potrošačke korpe i uporedio sa sličnim namirnicama iz Slovenije. Iako ni Slovenija u tom momentu nije imala zakonsku regulativnu sadržaja TMК u hrani (koju je u međuvremenu uvela), sadržaj TMК u našim namirnicama bio je značajno veći. Ipak, primećeno je da neki proizvođači nemaju TMК u svojim proizvodima što pokazuje da slede preporuke Svetske zdravstvene organizacije. Imajući u vidu negativan zdravstveni efekat TMК iz hrane, iako su pojedini proizvođači uklonili TMК iz svojih proizvoda, Srbiji je i dalje potreban zakon koji bi ograničio TMК u hrani a time bi se i značajno smanjio unos TMК u populaciji. Dugoročnio, ovaj zakon bi značajno doprineo opštem zdravlju stanovništva.


Izjava Dr Marije Glibetić

Dešavanja/Najave

Arhiva

Flag Counter

48??8?